肿瘤可以携带数百种不同基因的突变，每一种基因都可能以不同的方式发生突变——一些突变只是用另一个DNA核苷酸替换一个DNA核苷酸，而另一些突变则插入或删除更大的DNA片段。到目前为止，还没有办法快速、轻松地在自然环境中筛选每一种突变，以了解它们在肿瘤的发生、进展和治疗反应中可能发挥的作用。麻省理工学院的研究人员现在利用一种基于CRISPR基因组编辑的方法“先导编辑（prime editing）”，设计出了一种更容易的、高通量筛选这些突变的方法。研究人员说，这项技术也可以应用于许多其他的癌症基因，并最终可以用于精准医疗，以确定单个患者的肿瘤对特定治疗的反应。麻省理工学院的研究生Samuel Gould是该论文的主要作者，该论文今天发表在《Nature Biotechnology》杂志上。


文章摘要

肿瘤基因组通常包含复杂的单核苷酸改变和染色体重排，可以扰乱蛋白质功能。先导编辑（prime editing）已被应用于组装和评估遗传变异，但先前的方法受到prime editing引导RNA的可变效率的限制。在这里，作者提出了一种高通量的先导编辑传感器策略，将先导编辑引导RNA与其同源靶位点的合成版本结合起来，定量评估内源性遗传变异的功能影响。作者筛选了超过1000种内源性癌症相关的p53变异——这是癌症中最常见的突变基因——以确定以不同机制方式影响p53功能的等位基因。作者发现某些内源性TP53变异，特别是那些在p53寡聚化域，在外源性过表达系统中显示相反的表型。这个研究结果强调了基因剂量在影响天然蛋白质化学计量和蛋白质相互作用方面的生理重要性（用基因过表达来研究基因功能有时并不适合），并建立了一个在内源性序列背景下大规模研究遗传变异的框架。


研究背景

许多人类疾病与各种基因改变有关，这些改变可能相当复杂，可以根据改变的类型、基因功能和生物学背景，以不同的方式影响许多基因。但是，在人类肿瘤中观察到的数千种独特突变对功能的影响仍然知之甚少。此外，了解不同类型的突变对不同残基和蛋白质结构域的影响将提高我们对基因和蛋白质功能的基本理解。

研究遗传变异的方法往往局限于低通量、基于同源定向修复(HDR)的方法，或高通量、非生理基因过表达系统。前一种方法虽然功能强大，但由于HDR的要求及其主要局限于主动分裂细胞，因此缺乏可扩展性和通用性。基因过表达系统的要求较低且可扩展，但由于缺乏内源性基因调控机制，因此无法从生理上概括这些变异所驱动的生物学，其中许多机制对于感兴趣的基因来说是未知的。最近发展的精确基因组编辑工具，包括碱基编辑和先导编辑，能够让这些变异在其原生、内源性基因组环境中建模，提高编辑效率，实现更高的通量。

prime editing可以有效地产生任何类型的小突变，包括所有SNV和小的插入和缺失(indels)。prime editing是通过在先导编辑引导RNA (pegRNA)中编辑指令，来设计感兴趣的突变。pegRNA包含一个protospacer(“搜索”序列，引导)、Cas9结合区域以及3’端的扩展序列(“替换”序列，引入突变)。pegRNA和nCas9（具有单链切割活性并融合了M-MLV逆转录酶的Cas9 nickase）组成的复合物通过pegRNA引导下识别目标靶序列并结合与guide RNA互补的目标DNA链，Cas9酶切割目标DNA链protospacer特定位置产生单切口；断裂的DNA单链与PBS结合，逆转录酶沿着替换序列逆转录，生成编辑序列；编辑序列与原序列会竞争性与另一条链结合，未结合的序列则会被切除。


研究工作

研究人员根据超过40,000名癌症患者中观察到的1,000多个TP53变异，构建筛选了一个超过28,000个pegRNA的文库，这是迄今为止研究的最大的内源性TP53变异文库，每个变异有近30个pegRNA。构建慢病毒和转导细胞，7天后评估基因组进行验证，并分析编辑结果。

筛选数据分析揭示了TP53变异对功能影响，挑战了大多数 p53 变异（尤其是 DBD 中的变体）在功能上冗余的观点。其中包括位于 p53 OD 内的变异，通过后续实验进行了功能验证其中一些最近被证明是患有 Li-Fraumeni 综合征的人类中真正的致病性变体。研究结果表明这种方法能够对患者中观察到的变异进行高通量分析，以在不同的背景下进行功能筛选，阐明变异功能，以提高我们对患者进行分层和治疗的能力。


作者解析

研究人员通过筛选具有1000多种不同肿瘤抑制基因p53突变的细胞来展示他们的技术，所有这些突变都在癌症患者中被发现。这种方法比任何现有的方法都更容易、更快，而且是编辑基因组，而不是引入人工版本的突变基因，它揭示了一些p53突变比以前认为的更有害。

“在一个实验中，你可以生成数千种在癌症患者身上看到的基因型，并立即测试其中一种或多种基因型是否对你感兴趣的任何类型的治疗敏感或耐药，”麻省理工学院生物学助理教授、科赫综合癌症研究所成员、该研究的资深作者Sanchez-Rivera说。

这项新技术建立在Sanchez-Rivera10年前作为麻省理工学院研究生开始的研究基础上。当时，Sanchez-Rivera与生物学教授Tyler Jacks以及当时的博士后Thales Papagiannakopoulos合作，开发了一种利用CRISPR基因组编辑技术将与肺癌相关的基因突变引入小鼠体内的方法。在那项研究中，研究人员表明，他们可以敲除肺肿瘤细胞中经常丢失的基因，由此产生的肿瘤与自然产生的具有这些突变的肿瘤相似。然而，这种技术不允许产生点突变(用一个核苷酸替换另一个核苷酸)或插入。Sanchez-Rivera说:“虽然一些癌症患者的某些基因缺失，但癌症患者肿瘤中的绝大多数突变还包括点突变或小插入。”

从那以后，哈佛大学化学与化学生物学系教授、Broad研究所核心成员David Liu开发了新的基于CRISPR的基因组编辑技术，可以更容易地产生额外类型的突变。利用2016年开发的碱基编辑技术，研究人员可以设计点突变，不过不是所有可能的点突变。2019年，刘开发了一种称为“先导编辑prime editing”的技术，可以引入任何类型的点突变，以及插入和删除。“理论上，先导编辑解决了早期基于CRISPR的编辑技术面临的一个主要挑战，允许你设计几乎任何类型的突变。”

当Sanchez-Rivera和Gould开始研究这个项目时，他们计算出，如果成功的话，prime editing可以用来产生99%以上的癌症患者身上看到的小突变。然而，为了实现这一目标，他们需要找到一种方法来优化基于CRISPR的系统的编辑效率。用于指导CRISPR酶在特定位点切割基因组的先导编辑引导RNA(pegRNAs)具有不同程度的效率，这导致来自pegRNAs的数据中的“噪音”，这些数据根本无法产生正确的目标突变。麻省理工学院的研究小组设计了一种方法，通过使用合成目标位点来帮助他们计算他们测试的每个引导RNA的工作效率，从而减少噪音。

“我们可以设计具有不同设计特性的多个引物编辑指导RNA，然后我们可以对每个pegRNA的效率进行经验测量。它告诉我们每个pegRNA实际上引入正确编辑的时间百分比，”Gould说。


分析突变

研究人员利用p53基因展示了他们的技术，这种基因在一半以上的癌症患者中都会发生突变。从一个包括来自4万多名患者的测序信息的数据集中，研究人员确定了p53可能发生的1000多种不同的突变。“我们想把重点放在p53上，因为它是人类癌症中最常见的突变基因，但只有p53最常见的变异才得到了真正的深入研究。p53的许多变异仍未得到充分研究。"

利用他们的新方法，研究人员在人肺腺癌细胞中引入p53突变，然后测量这些细胞的存活率，从而确定每种突变对细胞适应性的影响。他们发现使用新的先导编辑技术引入一些p53突变后对细胞生长的促进作用比之前认为的要大，这些突变阻止p53蛋白形成四聚体从而使细胞存活下来——而之前已经用p53基因过表达进行研究认为这些突变没有给癌细胞带来任何生存优势，应被归类为良性。新的研究表明，在更自然的情况下，它们并非如此。

Gould说:“在这种情况下，如果你在自然环境中设计变异，而不是在这些更人工的系统中，你真正能观察到这些变异诱导的表型。”“这只是一个例子，但它说明了一个更广泛的原则，即我们将能够使用这些新的基因组编辑技术来获取新的生物学。”

因为很难重新激活肿瘤抑制基因，所以很少有针对p53的药物，但研究人员现在计划研究在其他癌症相关基因中发现的突变，希望发现可能针对这些突变的潜在癌症治疗方法。他们还希望这项技术有一天能够实现治疗肿瘤的个性化方法。

Sanchez-Rivera说:“随着临床测序技术的出现，我们将能够利用这些遗传信息为患有特定基因组成的肿瘤的患者量身定制治疗方法。”“这种基于先导编辑的方法有可能改变一切。”