引言

  • 感染伤口是由于细菌等微生物引发的疾病，常见的细菌包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌。慢性感染伤口愈合缓慢，易发于卧床、糖尿病和免疫系统受损的患者，给其带来额外的经济和情感负担。

  • 目前治疗感染伤口的方法包括常规清创、口服抗生素、抗菌敷料、负压伤口治疗等，但这些方法受到生物膜阻碍、抗生素耐药性增加及频繁更换敷料等问题的限制。为此，需要一种微创且能促进药物渗透并实现长期有效性的创新治疗策略。

  • 益生菌因安全且能去除有害细菌，在伤口治疗中备受关注。例如罗伊氏乳杆菌等益生菌已制成水凝胶敷料等制剂来促进感染伤口愈合。为保护益生菌活性，已使用多种生物材料进行递送。然而，如何在深部组织保持其高活力和长效抗菌作用仍需探索。

  • 过去20年来，微针（MN）作为一种透皮给药方式，已广泛用于多种生物医学应用，包括避孕、糖尿病治疗和癌症治疗。MN还被用于活生物体如益生菌的递送，因其提高了递送效率和患者依从性。尽管已有微针用于益生菌的局部给药，但针对加速感染伤口愈合的MN贴剂设计仍未被充分探索。    

  • 该研究开发了一种乳酸杆菌罗伊氏（L. reuteri）负载的MN贴剂，用于促进感染伤口愈合。实验结果表明，该贴剂在小鼠感染伤口愈合中表现优于其他对照组，具有抗菌和促进伤口愈合方面的潜力。

图1. 示意图


研究结果|

图2. GLMN贴片的制备与表征


为确定负载益生菌的MN贴片中最佳的甘油（GL）含量，研究制造了不同GL浓度的MN贴片（0%、2.5%、5%、10%、15%）。结果显示，含0%至10%GL的MN贴片成功制备，其中5%GL含量的MN贴片在皮肤应用中表现出最佳的插入和溶解能力。15%GL贴片因甘油过多而难以保持结构。机械强度测试表明，5% GL MN具有适当的机械强度，且在离体皮肤中溶解最快，释放速率也优于其他浓度的MN贴片。因此，5%GL浓度的MN贴片在皮肤递送中效果最佳。              

图3. 5%GLMN贴片的制备及Reuterin的抑菌效果


研究制造的GL MN贴片包含锥形微针，底部半径200μm，高度850μm，尖端半径约10 μm，排列在7mm×7mm的区域内。FESEM图像显示L. reuteri被有效封装在MN中，并保持良好形态。LC-MS分析确认L. reuteri产生抗菌剂Reuterin。定量分析表明，5% GL MN中的L. reuteri产生更多的Reuterin，且其在MN中产生的Reuterin显示出长期抗菌效果。此外，Reuterin对常见细菌（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌）具有广谱抗菌活性。              

图4. 5% GLMN的体外抗菌作用


为评估GLMN贴片的抗菌活性，研究对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌进行SYTO-9/PI试验。结果显示，5%GL MN处理24小时后，细菌活性显著降低。与REMN相同，5%GLMN在LB琼脂平板上几乎完全抑制细菌生长。在LB液体培养基中，5%GLMN处理后细菌几乎完全被抑制。抑菌圈直径分别为大肠杆菌 20.83 ± 1.02 mm、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌 21.93 ± 0.66 mm，表明其强效抗菌作用。              

图5. GLMN贴片体外清除生物膜的效果


5% GL MN贴片在共聚焦激光扫描显微镜和结晶紫染色分析中显示出最佳的金黄色葡萄球菌生物膜清除效果，效果与RE MN贴片相当。这表明5% GL MN贴片的抗菌效果主要归功于其产生的抗菌化合物Reuterin，与已有研究结论一致。              

图6. GLMN贴片的体外抗炎作用


在体外研究中，将RAW 264.7细胞与S.aureus或S.aureus+L.reuteri负载的MN贴片共孵育24小时后，流式细胞术显示CD86的表达显著下调，可能是由于有害细菌生长受抑制和毒素减少所致。5% GLMN贴片的抗炎作用通过实时定量PCR和蛋白质印迹验证，结果显示IL-6和TNF-α的表达水平显著降低。这些结果表明，5% GLMN贴片有效保护负载的L.reuteri，展现出强大的抗菌和抗炎特性。              

图7. 5% GLMN的细胞毒性和稳定性


根据对GLMN贴剂在形态学、皮肤渗透性、机械强度、溶出速度和抗菌效力方面的评估，确定5% GLMN贴剂能够有效递送L.reuteri以实现抗菌目的。为评价其细胞毒性，采用钙黄绿素/PI染色试剂盒分析NIH-3 T3细胞和HUVEC在与5% GLMN贴剂、罗伊氏菌素、PVA/蔗糖或5%甘油孵育24小时后的细胞活力。结果显示，与对照组相比，5% GL MN贴剂及其组分对细胞活力无显著影响，表明其生物相容性良好。为评估L.reuteri在5% GL MN贴剂中的存活率，分别在室温和4℃下保存MN贴片。结果表明，室温下贴剂中可存活7天，保留超过40%的活细菌。而在4℃下，益生菌可保持超过80%的活力长达60天，甚至在90天后仍有约50%存活，显示其长期稳定性。总之，5% GLMN贴剂表现出良好的生物相容性和长期稳定性，是一种有效的益生菌递送系统。              

图8. 5% GL MN贴片的体内抗菌效果


为进一步评估5% GLMN贴剂的抗菌效果及促进创面愈合的能力，研究建立了小鼠全层皮肤创面模型，并感染金黄色葡萄球菌，2天后分为5组。伤口面积分析显示，5% GL MN处理的伤口恢复最快，第9天伤口面积仅为0.69% ± 0.12%，而其他组分别为11.83% ± 1.38%、8.51% ± 1.27%、8.70% ± 0.14%和5.82% ± 0.82%。5% GLMN贴剂组的伤口未检测到金黄色葡萄球菌的存在，表明其具有卓越的抗菌效力。此外，伤口愈合过程中小鼠体重未见显著变化，显示5% GLMN贴剂在体内具有良好的生物安全性。这些结果表明，5% GLMN贴剂在体内表现出良好的生物相容性和生物安全性，并有效促进伤口愈合。              

图9. 不同治疗后组织再生、炎症反应和血管生成的研究


为进一步验证5% GLMN贴剂在伤口愈合中的疗效，研究通过组织学分析评估其对创面再生的影响。H&E结果显示，第9天5% GLMN贴剂处理组的伤口几乎完全闭合，伤口肉芽组织的长度和厚度显著低于其他组。Masson染色显示5% GLMN处理组的胶原沉积量最多，显著高于其他组。免疫组化结果表明，5% GLMN贴剂显著降低伤口部位的IL-6水平，表明其具有显著的抗炎作用。血管生成方面，5% GLMN组的CD 31染色显示，伤口部位的微血管密度显著更高，表明该贴剂促进血管生成。综上所述，5% GLMN贴剂在加速伤口愈合、促进胶原沉积、减少炎症以及增强血管生成方面表现出显著效果。

        

总结

感染伤口愈合的延迟通常是细菌感染和局部炎症的结果，这给患者和社会带来了严重的负担，而且往往被低估。由于伤口生物膜的存在，作为限制各种抗菌药物进入的屏障，目前用于慢性伤口感染的治疗通常存在药物渗透性有限和频繁给药的问题。该研究报告了一种生物相容性益生菌微针贴片的设计，该贴片可以快速将有益细菌递送到伤口组织，并提高递送效率。益生菌能够通过代谢引入的甘油而持续产生抗微生物物质，从而通过长效抗菌和抗炎作用促进感染伤口愈合。此外，有益细菌可以在4°C下在MN内保持高活力（>80%）长达60天。在金黄色葡萄球菌感染伤口的小鼠模型中，与对照组相比，MN贴剂的单次给药表现出上级抗菌效率和伤口愈合性能，表明加速感染伤口闭合的巨大潜力。进一步开发基于活益生菌的MN贴片可能使患者能够更好地管理慢性感染的伤口。



参考文献

Jin Y,Lu Y,Jiang X, et al. Accelerated infected wound healing by probiotic-based living microneedles with long-acting antibacterial effect. Bioact Mater. 2024;38:292-304. doi:10.1016/j.bioactmat.2024.05.008



转自公众号“读研小师弟”