基因敲除枯草芽孢杆菌
芽孢杆菌（Bacillus）是一类能产生抗力内生孢子的革兰氏阳性菌，细胞呈杆状且外层覆盖大量的吡啶二羧酸钙，存在芽孢和营养体两种形态。芽孢杆菌广泛存在于土壤、植物、食物以及动物肠道内，具有耐高温、快速复活和较强分泌酶等特点，在有氧和无氧条件下都能存活。其拥有众多具备特殊功能的菌株，目前应用较多的有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等类型，在医学、科学研究、畜禽养殖及农业等多个领域均展现出广泛的应用潜力。要充分利用枯草芽孢杆菌的潜力，就需要深入了解其基因功能和代谢途径。在这个过程中，基因敲除技术成为了一种不可或缺的工具。
基因敲除枯草芽孢杆菌的应用
- 基因功能研究：基因敲除技术是研究基因功能的重要工具。通过敲除枯草芽孢杆菌中的特定基因，可以观察该基因缺失对细菌生长、代谢、抗逆性等生物学特性的影响，从而揭示该基因在细菌生命活动中的关键作用。这种方法有助于深入理解细菌的基因调控网络和代谢途径，为生物技术的发展提供理论基础。
- 代谢工程优化：在代谢工程领域，基因敲除技术被用于优化枯草芽孢杆菌的生产性能。通过敲除不必要的代谢途径或增强目标产物的合成能力，可以提高生产效率，降低生产成本。例如，在核苷类产品的生产中，通过敲除枯草芽孢杆菌中的非必需基因并引入相关代谢途径的基因，可以显著提高鸟苷和胸苷的产量。这种优化策略不仅提高了产品的产量和质量，还为工业生产提供了更优质的原料。
- 构建工程菌株：基因敲除技术还可以用于构建表达外源蛋白的工程菌株。通过敲除枯草芽孢杆菌中的某些基因，可以消除其对特定抗生素的抗性或提高其对某些底物的利用效率，从而使其更适合作为基因工程的受体菌株。此外，通过敲除与副产物形成相关的基因，可以减少副产物的生成，提高目标产物的纯度和产量。这些工程菌株在生物技术、医药和食品工业等领域具有广泛的应用前景。
- 疾病研究与药物筛选：枯草芽孢杆菌作为模式生物，其基因敲除技术还可以用于疾病研究和药物筛选。通过构建具有特定基因缺陷的枯草芽孢杆菌菌株，可以模拟人类疾病状态，从而评估药物在特定疾病状态下的疗效和安全性。这种方法为新药研发提供了有力的支持，有助于加速药物的研发进程。
CRISPR-Cas9基因敲除枯草芽孢杆菌研究案例
案例一、枯草杆菌基因一步敲除法的建立及其在蛋白酶缺陷株构建中的应用
为解决枯草芽孢杆菌表达系统蛋白酶问题而构建的缺失8个蛋白酶基因的WB800菌株染色体上残留了三个抗性标记（mpr::ble nprB::bsr wprA::hyg），影响该菌株的进一步改造及工程菌的构建。研究者用新建立的方法依次将这三个抗性标记删除，获得了一株“绿色的”蛋白酶缺陷株WB8003，作为后续外源蛋白表达的宿主菌。 该研究旨在建立一套快捷高效的枯草杆菌遗传学操作方法，并应用其对宿主菌进行改造，以提高外源蛋白的表达效率。研究者将Cre/loxP定点重组系统和重叠延伸PCR技术结合，建立了一套高效的枯草芽孢杆菌基因组操作方法。用重叠延伸PCR技术代替载体构建，快速地将目标敲除位点的上下游同源臂和抗性标记盒融合起来；用Cre/loxP定点重组系统代替菌体自身的重组系统，高效地删除抗性标记，整个操作过程可以在2天内完成，大大提高了效率。
案例二、抗菌脂肽产生菌的快速识别、筛选及抗菌脂肽的快速鉴定
研究者利用组合生物合成技术，对实验室保藏的一株Plipastatin产生菌Bacillus subtilis PB2进行分子改造，分别对其具有底物选择专一性的ppsC-A2结构域、具有完整功能的ppsC-Glu模块以及独立酶活性的ppsC亚基结构进行敲除，构建NRPS杂合酶系，探索新型脂肽类化合物的形成，并探究结构域、模块与亚基的缺失对诱导出现NRPS模块跳跃现象的影响及相互关系。 该研究主要关注抗菌脂肽类化合物的生物合成及其调控机制。研究者首先确定了脂肽类化合物NRPS生物合成过程的编码基因，以实验室保藏的芽孢杆菌作为研究对象，通过分子克隆技术对其编码基因进行检测，并辅以高效液相检测（HPLC）进行验证，从而推测芽孢杆菌生物合成抗菌脂肽类化合物的潜在能力。基于以上手段，研究者建立了一种抗菌脂肽产生菌快速识别、筛选和抗菌脂肽快速鉴定的方法。
由此得知，基因敲除技术在枯草芽孢杆菌研究中的广泛应用和重要地位，不仅提高了外源蛋白的表达效率，还为抗菌脂肽类化合物的生物合成及其调控机制的研究提供了新的思路和方法。