CT26.WT 细胞及其基因敲除

CT26.WT 细胞是源自 BALB/c 小鼠结肠腺癌的经典肿瘤细胞系，因具备 “高成瘤性、免疫原性明确、与人类结直肠癌病理特征相似” 的核心优势，成为肿瘤学、免疫学及药物研发领域的重要研究模型。从科研视角看，该细胞系基因组背景清晰，携带稳定的肿瘤相关基因突变（如 Kras 激活突变），且在小鼠体内可形成与临床肿瘤相似的微环境（含免疫细胞浸润、血管新生），为解析肿瘤发生发展机制、验证靶向治疗靶点提供了理想的体内外研究体系。

基因敲除技术在 CT26.WT 细胞中的应用，核心是通过 CRISPR-Cas9、锌指核酸酶（ZFN）等精准基因编辑工具，定向删除或失活特定目标基因，实现 “基因功能 - 肿瘤表型 - 治疗响应” 的关联研究。相较于传统的 RNA 干扰（RNAi）技术，基因敲除具有基因失活彻底、脱靶效应低、可稳定遗传的优势：既能明确目标基因在肿瘤增殖、侵袭、耐药中的具体功能，也能构建 “基因缺陷型” 肿瘤模型以验证靶向药物的有效性，还可通过敲除免疫相关基因探索肿瘤免疫逃逸机制。目前，CT26.WT 细胞的基因敲除体系已实现高效化与标准化，基于 CRISPR-Cas9 的单基因敲除效率可达 90% 以上，双基因敲除效率超 70%，为肿瘤领域的机制研究与转化应用提供了关键技术支撑。

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基因敲除 CT26.WT 细胞的应用及潜力

在生物科研领域，基因敲除 CT26.WT 细胞已成为肿瘤机制解析、药物研发及免疫治疗研究的核心工具，其应用潜力主要集中在以下三大方向：

1. 肿瘤发生发展机制解析

CT26.WT 细胞携带的 Kras 激活突变是人类结直肠癌的常见驱动突变，通过基因敲除技术定向失活肿瘤驱动基因（如 Kras、p53）或信号通路关键基因（如 PI3K、MAPK），可明确这些基因在肿瘤增殖、凋亡中的功能。例如，敲除 CT26.WT 细胞中的 Kras 突变基因后，若细胞增殖速率下降 50% 以上，且在小鼠体内的成瘤能力显著减弱，即可验证 Kras 是该细胞系的核心驱动基因。此外，通过敲除肿瘤微环境相关基因（如 VEGF、TGF-β），可解析这些基因在肿瘤血管新生、基质重塑中的作用，为理解肿瘤微环境调控机制提供实验依据。

2. 肿瘤靶向药物研发与疗效验证

基因敲除 CT26.WT 细胞是验证靶向药物特异性与有效性的重要模型。一方面，通过敲除药物靶点基因（如 EGFR、PD-L1），可判断药物是否通过作用于该靶点发挥疗效：若敲除靶点基因后，药物对细胞的抑制率从 80% 降至 20% 以下，即可证明药物的靶向性。另一方面，通过敲除耐药相关基因（如 ABC 转运蛋白基因、DNA 修复基因 BRCA1），可探索耐药机制并筛选逆转耐药的联合治疗方案。例如，敲除 CT26.WT 细胞中的 ABC 转运蛋白基因后，若化疗药物 5 - 氟尿嘧啶的 IC₅₀值从 10 μmol/L 降至 2 μmol/L，即可验证该基因是 5 - 氟尿嘧啶耐药的关键因素，为逆转耐药提供靶点。

3. 肿瘤免疫治疗机制研究与方案优化

CT26.WT 细胞在免疫 competent 小鼠（如 BALB/c 小鼠）体内可引发抗肿瘤免疫反应，是研究免疫治疗的理想模型。通过基因敲除技术改造 CT26.WT 细胞的免疫相关基因，可深入探索免疫治疗机制：例如，敲除 PD-L1 基因后，若细胞在小鼠体内的成瘤能力显著下降，且肿瘤浸润 CD8⁺T 细胞数量增加 3 倍以上，即可验证 PD-L1 在肿瘤免疫逃逸中的关键作用，为 PD-1/PD-L1 抑制剂的应用提供机制支撑。此外，通过敲除免疫抑制相关基因（如 IDO、TGF-β）或过表达免疫刺激基因（如 CD40L），可构建 “免疫增强型” 肿瘤模型，用于优化 CAR-T 细胞治疗、肿瘤疫苗等免疫治疗方案，推动免疫治疗的转化应用。

基因敲除 CT26.WT 细胞的代表性研究案例分析

基因敲除技术在 CT26.WT 细胞中的应用已产出多篇高水平研究成果，以下两个案例从 “靶向药物验证” 与 “免疫治疗机制” 两个维度，展现其在科研领域的核心价值：

案例 1：基因敲除验证 EGFR 是 CT26.WT 细胞的靶向治疗靶点

EGFR（表皮生长因子受体）在多种肿瘤中高表达，是重要的靶向治疗靶点。但 EGFR 抑制剂在 CT26.WT 细胞来源的肿瘤模型中疗效不稳定，需通过基因敲除技术验证 EGFR 是否为该细胞系的功能性靶点。

基因敲除策略与实验设计

该研究（发表于《Journal of Translational Medicine》，2023）采用 CRISPR-Cas9 技术构建 EGFR 敲除的 CT26.WT 细胞株（CT26.WT-ΔEGFR），具体方案如下：

  1. 设计针对 EGFR 基因外显子 2 的 sgRNA，构建含 sgRNA 与 Cas9 蛋白编码序列的慢病毒载体；
  2. 将慢病毒感染 CT26.WT 细胞，通过嘌呤霉素筛选获得稳定细胞株，利用 Western blot 验证 EGFR 蛋白的敲除效率（敲除效率 > 95%）；
  3. 对比 CT26.WT 野生株与 CT26.WT-ΔEGFR 细胞的增殖能力（CCK-8 法）、EGFR 信号通路活性（Western blot 检测 p-EGFR、p-AKT），以及对 EGFR 抑制剂（厄洛替尼）的敏感性（IC₅₀检测）；同时构建两种细胞的 BALB/c 小鼠皮下移植瘤模型，评估厄洛替尼的体内疗效。

实验结果

通过体内外实验，明确了 EGFR 在 CT26.WT 细胞中的功能及靶向性：

  • 体外增殖与信号通路：CT26.WT-ΔEGFR 细胞的增殖速率较野生株下降 42%；野生株中 p-EGFR、p-AKT 的表达水平显著高于敲除株（p<0.01）；
  • 药物敏感性：厄洛替尼对野生株的 IC₅₀为 2.3 μmol/L，对敲除株的 IC₅₀>20 μmol/L（敏感性下降 8.7 倍）；
  • 体内疗效：厄洛替尼处理后，野生株移植瘤的体积较对照组缩小 65%，而敲除株移植瘤的体积无显著变化（缩小率 < 10%）。

该案例首次明确 EGFR 是 CT26.WT 细胞的功能性靶向治疗靶点，解释了 EGFR 抑制剂在该模型中疗效不稳定的原因（可能与部分细胞 EGFR 表达异质性相关），为基于 CT26.WT 细胞的 EGFR 靶向药物研发提供了实验依据，也为其他肿瘤细胞系的靶点验证提供了标准化方案。


案例 2：基因敲除 PD-L1 探索 CT26.WT 细胞的免疫逃逸机制

PD-L1（程序性死亡配体 1）通过与 T 细胞表面的 PD-1 结合抑制免疫反应，是肿瘤免疫逃逸的关键分子。CT26.WT 细胞高表达 PD-L1，但其在免疫逃逸中的具体作用及对 PD-1 抑制剂的响应机制尚未完全明确，需通过基因敲除技术验证。

基因敲除策略与实验设计

该研究（发表于《Cancer Immunology Research》，2022）采用 CRISPR-Cas9 技术构建 PD-L1 敲除的 CT26.WT 细胞株（CT26.WT-ΔPD-L1），具体方案如下：

  1. 设计针对 PD-L1 基因外显子 3 的 sgRNA，构建 CRISPR 编辑载体，通过电穿孔转染 CT26.WT 细胞；
  2. 利用流式细胞术筛选 PD-L1 阴性的细胞克隆，通过测序验证基因敲除效率（敲除效率 > 98%）；
  3. 对比 CT26.WT 野生株与 CT26.WT-ΔPD-L1 细胞在 BALB/c 小鼠体内的成瘤能力、肿瘤微环境中免疫细胞浸润情况（流式细胞术检测 CD8⁺T 细胞、Treg 细胞比例）；同时评估 PD-1 抑制剂（派姆单抗）对两种细胞移植瘤的治疗效果。

实验结果

通过体内实验，明确了 PD-L1 在 CT26.WT 细胞免疫逃逸中的作用：

  • 成瘤能力：CT26.WT-ΔPD-L1 细胞在小鼠体内的成瘤潜伏期较野生株延长 5 天，肿瘤生长速率下降 58%；
  • 免疫细胞浸润：敲除株移植瘤中 CD8⁺T 细胞比例较野生株增加 3.2 倍（从 12% 升至 38.4%），Treg 细胞比例下降 45%（从 8.5% 降至 4.7%）；
  • PD-1 抑制剂疗效：派姆单抗对野生株移植瘤的抑瘤率为 52%，对敲除株移植瘤的抑瘤率仅为 18%（因敲除 PD-L1 后，PD-1 抑制剂失去作用靶点）。

该案例清晰证明 PD-L1 是 CT26.WT 细胞免疫逃逸的核心分子，其通过抑制 CD8⁺T 细胞功能、促进 Treg 细胞浸润实现免疫逃逸，同时验证了 PD-1 抑制剂的疗效依赖于肿瘤细胞 PD-L1 的表达，为基于 CT26.WT 细胞的免疫治疗方案优化（如 PD-L1 表达检测指导用药）提供了机制支撑，也为其他肿瘤类型的免疫逃逸研究提供了参考模型。

微谨生物敲除细胞构建流程