基因敲除乳酸菌的科研基础简介

乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LAB）是一类革兰氏阳性、兼性厌氧的益生菌群，广泛存在于自然界及人和动物肠道中，因能发酵碳水化合物产生乳酸而得名，其基因组多为环状双链 DNA，大小约 1.8-3.3 Mb，包含大量与代谢调控、益生功能、耐药性及环境适应性相关的功能基因。基因敲除技术是基于同源重组、CRISPR-Cas 系统等分子生物学方法，精准删除乳酸菌基因组中特定目标基因的技术手段，核心原理是通过构建含同源臂的敲除载体，介导目标基因与载体片段发生重组交换，从而实现基因的定点缺失。该技术打破了传统诱变育种的随机性，为从分子层面解析乳酸菌基因功能、调控代谢通路提供了 “精准编辑” 工具，是现代微生物分子遗传学研究的核心技术之一。

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基因敲除乳酸菌在生物科研中的应用及潜力

基因敲除乳酸菌凭借其 “精准改造” 的特性，在生物科研领域展现出多维度应用价值，成为解析微生物功能、开发新型生物技术的重要载体：

  1. 基因功能验证：通过敲除目标基因（如乳酸脱氢酶基因 ldh、胞外多糖合成基因 eps、益生菌黏附基因 mapA 等），对比敲除菌株与野生型菌株在生长特性、代谢产物、环境适应性等方面的差异，可直接明确该基因的生物学功能，为乳酸菌分子机制研究奠定基础。
  2. 代谢通路解析与重构：乳酸菌的乳酸发酵、风味物质合成、益生活性物质（如细菌素、短链脂肪酸）产生等过程均由特定代谢通路调控，敲除通路中的关键基因（如分支酸合成酶基因 aroA、乙酸激酶基因 ackA）可阻断冗余支路或强化目标产物合成，助力解析代谢网络的调控逻辑，为代谢工程改造提供靶点。
  3. 肠道微生物互作研究：作为肠道益生菌的重要成员，乳酸菌与宿主肠道黏膜、其他微生物的互作机制是科研热点。通过敲除乳酸菌的黏附基因（如纤连蛋白结合基因 fnbp）、信号分子合成基因（如群体感应基因 luxS），可探究其在肠道定植、免疫调节、菌群平衡维持中的作用机制，为益生菌制剂的优化提供理论支撑。
  4. 新型表达载体构建：基因敲除技术可删除乳酸菌中无关的耐药基因、毒力因子基因（若存在），构建安全的 “空载体” 菌株，再通过同源重组插入外源基因（如抗原基因、酶基因），使其成为高效的微生物表达系统，应用于疫苗研发、工业酶生产等领域，具有低成本、高安全性的潜力。

基因敲除乳酸菌的代表性研究案例解析

案例一：CRISPR-Cas9 介导的乳酸菌乳酸脱氢酶基因敲除 —— 代谢通路重构研究

乳酸菌发酵产生的乳酸是食品发酵、生物基材料合成的重要原料，但传统菌株存在乳酸产量低、副产物（如乙酸）多的问题。乳酸脱氢酶（LDH）是乳酸合成的关键酶，敲除 ldh 基因可阻断乳酸合成，验证其在代谢通路中的核心作用，同时为重构高产目标产物的工程菌株提供依据。

研究方法与结果：

  • 以模式菌株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）WCFS1为研究对象，构建含 ldh 基因同源臂的 CRISPR-Cas9 敲除载体（载体包含 Cas9 基因、sgRNA 靶向 ldh 基因编码区、氯霉素抗性基因）；
  • 将载体电转化至植物乳杆菌感受态细胞，通过 Cas9 蛋白介导的 DNA 双链断裂，结合同源重组修复，实现 ldh 基因的定点敲除；
  • 对比野生型（WT）与敲除菌株（Δldh）的代谢产物：WT 菌株乳酸产量为 12.3 g/L，乙酸产量 1.8 g/L；Δldh 菌株乳酸产量降至 0.5 g/L，乙酸产量提升至 4.2 g/L，同时乙醇产量增加 3 倍，证实 ldh 基因是乳酸合成的必需基因，且阻断乳酸支路后，代谢流转向乙酸和乙醇合成通路。

 

该案例首次利用 CRISPR-Cas9 技术实现植物乳杆菌 ldh 基因的高效敲除，不仅明确了 LDH 在乳酸合成中的不可替代作用，还为通过基因编辑重构乳酸菌代谢通路、优化产物合成提供了成熟技术方案，后续可通过导入高活性 ldh 突变基因，构建高产乳酸的工程菌株。


案例二：乳酸菌黏附基因 mapA 敲除 —— 肠道定植机制研究

研究背景：乳酸菌在肠道内的定植能力是其发挥益生作用的前提，黏附基因 mapA 编码的黏附蛋白可介导乳酸菌与宿主肠道上皮细胞的结合，但其在定植过程中的具体作用尚未完全明确，需通过基因敲除验证。

研究方法与结果：

  • 选取肠道益生菌鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）GG为研究对象，采用同源重组法构建 mapA 基因敲除载体（同源臂长度 500 bp，含红霉素抗性基因）；
  • 通过接合转移将载体导入鼠李糖乳杆菌 GG，筛选获得 mapA 敲除菌株（ΔmapA）；
  • 体外肠道上皮细胞（Caco-2 细胞）黏附实验：WT 菌株黏附率为 23.5%，ΔmapA 菌株黏附率降至 4.8%，显著低于 WT；
  • 体内定植实验：给小鼠灌胃 WT 和 ΔmapA 菌株，7 天后检测肠道菌群，WT 菌株在盲肠、结肠的定植量分别为 10⁷ CFU/g、10⁶ CFU/g，而 ΔmapA 菌株定植量仅为 10⁴ CFU/g、10³ CFU/g，且 3 天后即难以检测到。

 

 

该研究通过基因敲除直接证实 mapA 基因编码的黏附蛋白是乳酸菌肠道定植的核心因子，为解析乳酸菌 - 宿主肠道的互作机制提供了关键证据，同时为益生菌制剂的改良指明方向 —— 通过强化 mapA 基因表达，可提升乳酸菌的肠道定植能力，增强益生效果。